Diane Bahuaud defended her PhD thesis on June 26th 2009

Ane Gro Siri Skjelfjord

**Atlantic salmon (Salmo salar L.) flesh quality – Role of lysosomes and cathepsins in muscle degradation**

The aim of this PhD project was to study the influence of four main factors (super-chilling, dietary lipids, pre-slaughter crowding stress and genetic background represented by different families of fish) on Atlantic salmon flesh quality, with focus on the implication of lysosomes and lysosomal enzymes, cathepsins B and L, in muscle structure degradation and flesh texture. The microstructure of the muscle was studied by light microscopy, and the level of muscle degradation was evaluated by the percentage of detachments between myofibres and between myofibre and myocommata, the percentage of myofibre breakages and contracted myofibres, and the presence of intra- and extra-cellular ice crystals. Liquid leakage and fillet texture evaluated instrumentally as fillet firmness were also investigated. Finally, lysosomal cathepsin B and L activities and relative gene expressions were studied; the activity being measured in the lysosomal fraction when the treatment was applied to the salmon post mortem and in the muscle homogenate for total activity when the treatment was applied pre mortem. The effects of Modified Atmosphere Packaging (MAP) and pre-rigor filleting on muscle structure integrity were also studied.

Atlantic salmon flesh quality was affected by the four main factors studied in this PhD project. Cathepsin B and/or L were also influenced by these factors and seemed to be involved in the final quality of salmon flesh. Cathepsins may have acted at the myofibrillar level, as myofibre breakages could be seen in some cases (super-chilling and pre-slaughter stress), but also at the connective tissue level, as shown by the increased percentage of myofibre-myofibre detachments for all factors, and myofibre-myocommata detachments in the case of pre-slaughter stress. Cathepsin B and/or L activities and/or gene expressions were significantly negatively correlated to muscle pH, myofibre-myofibre and myofibre-myocommata attachments, and fillet firmness.

Super-chilling of Atlantic salmon fillets resulted in the formation of intra- and extra-cellular ice crystals, presumably causing the release of cathepsins from the lysosomes to the cytosol during chilled storage. Our results indicated that the release of cathepsins into the cytosol had direct consequences on muscle structure integrity, as shown by the higher percentage of myofibre-myofibre detachments until 24 h post-mortem, but also the higher level of myofibre breakages and liquid leakage. Fillet firmness measured 96 h post-mortem was not affected by super-chilling. MAP significantly decreased cathepsin B + L activity in the muscle, but pre-rigor filleting compared 96 h and 192 h post-mortem with post-rigor filleting, did not give any significant changes in enzyme activity or muscle quality.

Dietary lipids influenced the lysosomal system integrity and the biosynthesis of lysosomal cathepsins B and L. Replacement of fish oil by rapeseed oil in Atlantic salmon diet did not result in any significant changes in muscle integrity, or cathepsin B and L activities or gene expressions. Feeding Atlantic salmon with very high levels of either EPA or DHA (>50 % n-3 fatty acids in the dietary lipids), however, caused a higher percentage of myofibre-myofibre detachments, and a significant decrease of cathepsin B and L total activities in the muscle homogenates. The decrease of cathepsin activities probably resulted from the formation of hydroperoxides, due to a high oxidative stress, as shown by the impairment of the mitochondrial and peroxisomal functions measured in two other parallel studies. Oxidative stress caused by the presence of very high level of n-3 fatty acids seemed to have disturbed the lysosomal function as well, as cathepsin B and L activities were decreased, whereas cathepsin B gene expression was increased. The fatty acid composition of the muscle lysosomal fraction reflected the fatty acid composition of the diet. In the very high level of dietary n-3 fatty acid groups (EP A and DHA), the lysosomal fraction therefore contained a very high level of PUFAs, whose presence in a too high quantity could result in increased fragility of the lysosomal membrane.

Pre-slaughter long-term crowding stress (24 h) of Atlantic salmon lead to an acceleration of the decrease of muscle pH, lowering this pH probably already ante-mortem. The low muscle pH seemed to be responsible for an early activation of cathepsin B total activity, and the significant increase of cathepsin L gene expression. The increase in cathepsin B activity and/or cathepsin L gene expression was positively correlated to the increase in myofibre-myofibre and myofibre-myocommata detachments, as well as to fillet softness. Our results therefore suggested that muscle pH due to pre-slaughter stress seemed to play a major role in the activation of cathepsins and in consequent fillet quality degradation.

Different families of Atlantic salmon presented significant variations in fillet firmness measured at 2 and 5 days post-mortem. Fillet firmness was significantly negatively correlated with cathepsin L activity measured at 2 days post-mortem, showing that the higher the cathepsin L activity, the softer the fillet; strongly suggesting that its activity may have a direct impact on fillet firmness. Calpain activity was however not significantly correlated to fillet firmness, but significant differences between textural groups could be observed. Selection of Atlantic salmon for fillet texture may thus possibly be done according to the level of cathepsin L total activity in the muscle.

Keywords: Atlantic salmon, fish quality, super-chilling, myofibre-myofibre detachments, myofibre-myocommata detachments, Cathepsin B, Cathepsin L, cathepsines, lysosomes, texture, liquid leakage, myofibre breakages, myofibre contraction, muscle quality, fatty acids, EPA, DHA, rapeseed oil, fish oil, stress, pH, protease, muscle degradation, calpains, firmness

Résumé

Le but de ce projet de doctorat (PhD) était d'étudier l'influence de quatre principaux facteurs (super-réfrigération (super-chilling), différents types de lipides dans l' alimentation, stress avant abattage et background génétique représenté par différentes familles de poissons) sur la qualité de la chair de saumon de l' Atlantique. L'implication des lysosomes et de deux de leurs enzymes, les cathepsines B et L, dans la dégradation de la structure du muscle et de la texture de la chair, a reçu un attention particulière. La microstructure du muscle a été étudiée par microscopie, et Ie niveau de dégradation du muscle a été évalué grâce au pourcentage de détachements entre les myofibres (fibres musculaires) et entre Ie myocommata (connective tissue) et les myofibres, au pourcentage de cassures et de contraction des myofibres, et à la présence ou non de cristaux de glaces intra- et extracellulaires. Perte de liquide et texture de filet mesurée au moyen d'un instrument en tant que «fermeté du filet », ont aussi été évalués. Enfin,l'activité et l'expression génétique relative des cathepsines lysosomales B et L ont été étudiées ; l'activité ayant été mesurée dans la fraction lysosomale lorsque Ie traitement était appliqué aux saumons post-mortem, et dans les homogénats de muscle pour une activité totale lorsque Ie traitement était appliqué pre-mortem. Les effets de l'emballage en atmosphère modifiée (MAP) et du filetage pre-rigor, sur l'integrité de la structure musculaire, ont également été considérés.

La qualité de la chair du saumon de l'Atlantique a été affectée par les quatre principaux facteurs évalués dans ce projet de PhD. Les cathepsines B et/ou L ont également été influencées par ces facteurs, et il semblerait qu'elles soient impliquées dans la qualité finale de la chair de saumon. Il est possible que les cathepsines aient agi au niveau myofibrillaire, puisque des cassures dans les myofibres ont été remarquées dans certains cas (super-réfrigération et stress), mais aussi au niveau du tissue conjonctif, comme l'ont montré l'augmentation des pourcentages de détachements entre les myofibres pour tous les facteurs, et de détachements entre myocommata et myofibres dans Ie cas du stress avant abattage. L'activité et l'expression génétique relative des cathepsines B et/ou L étaient négativement corrélées au pH musculaire, aux attachements entre myofibres et entre myocommata et myofibres, et à la fermeté des filets, de façon significative statistiquement.

La super-réfrigération des filets de saumon de l' Atlantique a causé la formation de cristaux de glaces intra- et extracellulaires, provoquant probablement Ie déversement des cathepsines depuis les lysosomes vers Ie cytosol, pendant la période de stockage en réfrigération. Nos résultats ont indiqué que Ie déversement des cathepsines dans Ie cytosol a eu des conséquences directes sur l'intégrité de la structure musculaire, comme l'ont montré de plus hauts pourcentages de détachements entre myofibres jusqu'à 24 h post-mortem, mais aussi de plus haut niveaux de cassures de myofibres et de perte de liquide. La fermeté de filet mésurée à 96 h post-mortem n'a pas été affectée par la super-réfrigération (super-chilling). MAP a diminué significativement I'activité des cathepsines B + L dans Ie muscle, mais Ie filetage pre-rigor comparé à 96 et 192 h post-mortem avec Ie filetage post-rigor, n'a pas donné de changements significatifs en ce qui concerne I'activité enzymatique ou la qualité du muscle.

Les différents types de lipides dans I'alimentation ont influencé I'intégrité du système lysosomal et Ia biosynthèse des cathepsines B et L. Le remplacement de I'huile de poisson par I'huile de colza dans Ie régime alimentaire du saumon de l'Atlantique n'a pas significativement modifié I'intégrité du muscle, ou I'activité et I'expression génétique relative des cathepsines B et L. Nourrir les saumons de I'Atlantique avec des niveaux très hauts, soit d'EPA, soit de DHA (> 50 % d'acides gras n-3 dans les lipides alimentaires), a cependant causé I'augmentation du pourcentage de détachements entre les myofibres, et la diminution significative de I'activité totale des cathepsines B et L dans les homogénats de muscle. La diminution de I'activité de cathepsines était probablement due à Ia formation d'hydropéroxides, causée par un stress oxydatif élevé, comme la perturbation des fonctions mitochondriale et péroxisomale I' ont montré dans deux autres études parallèles sur les mêmes individus. II semblerait que Ie stress oxydatif causé par Ia présence du très haut niveau d'acides gras n-3 ait également perturbé la fonction Iysosomale, puisque I'activité des cathepsines B et L était diminuée significativement, alors que I'expression génétique de cathepsine B, elle, était augmentée. La composition en acides gras de Ia fraction Iysosomale reflétait la composition en acides gras du régime alimentaire. Dans Ies groupes de saumons ayant ingéré de très hauts niveaux d'acides gras n-3 (EPA et DHA), la fraction Iysosomale contenait par conséquent aussi de très hauts niveaux d'acides gras polyinsaturés, dont la présence en trop grande quantité pourrait entraîner une augmentation de la fragilité de la membrane Iysosomale.

Le stress prolongé (24 h) avant abattage chez Ie saumon de I' Atlantique a provoqué une accélération de la diminution du pH musculaire, probablement aussi déjà pre-mortem. Le pH musculaire bas était apparemment responsable de I'activation précoce de I'activité totale de cathepsine B, et de l'augmentation significative de I'expression génétique de cathepsine L. L'augmentation en activité de cathepsine B et /ou en expression génétique de cathepsine L était positivement corrélée à l'augmentation des détachements entre myofibres et entre myocommata et myofibres, mais aussi à la tendreté du filet. Nos résultats suggéraient que Ie pH musculaire du au stress avant abattage semblait jouer un rôle majeur dans l'activation des cathepsines et par conséquent dans la dégradation de la qualité du filet.

Les différentes families de saumons de l' Atlantique ont présenté des variations significatives en fermeté de filets mesurée à 2 et 5 jours post-mortem. La fermeté de filet était négativement corrélée et de façon significative avec I'activité de cathepsine L mesurée à 2 jours post-mortem, montrant que plus I'activité en cathepsine L était élevée, moins les filets étaient fermes. Ceci suggérait fermement que I'activité de cathepsine L pourrait avoir un impact direct sur la fermeté du filet. L'activité des calpains dans Ie muscle n'était cependant pas corrélée significativement avec la texture des filets, même si des différences significatives ont pu être détectées entre les différents groupes texturaux. La sélection des saumons de I' Atlantique pour la fermeté des filets pourrait donc peut-être se faire sur la base du niveau d'activité totale de cathepsine L dans Ie muscle.

Keywords: Atlantic salmon, fish quality, super-chilling, myofibre-myofibre detachments, myofibre-myocommata detachments, Cathepsin B, Cathepsin L, cathepsines, lysosomes, texture, liquid leakage, myofibre breakages, myofibre contraction, muscle quality, fatty acids, EPA, DHA, rapeseed oil, fish oil,stress, pH, protease, muscle degradation, calpains, firmness

Updated: 01.07.09
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