Morfologisk og molekylær karakterisering av utvikling av virvelfusjoner hos atlantisk laks
Problemer med deformerte ryggvirvler hos Atlantisk laks (Salmo salar) har vært stadig mer i fokus på grunn av dens betydning i oppdrettsnæringen. Inntil nylig har den molekylære utvikling av ryggdeformiteter i fisk fått relativt lite oppmerksomhet og de fleste studier har i stor grad vært deskriptive. Basert på økonomiske hensyn har tidligere studier primært vært basert på å avdekke spesifikke utløsende faktorer som induserer deformiteter. Til dette har man benyttet forskingsverktøy som røntgen, histologi og feltstudier. Studier av intensive produksjonsregimer og forekomst av misdannelser har etter hvert blitt fulgt av mer avanserte studier av ryggvirvelutvikling og benbiologi. En bedre forståelse av cellulære og molekylære mekanismer i benutviklingen hos teleoster vil gi oss et bedre grunnlag til å forstå patologien, bidra til å definere spesielle behov og dermed minske forekomsten av skjelettdeformiteter.
Målet med artikkel I, II og III var å studere den langsiktige effekten av hyperthermi på benutvikling hos Atlantisk laks med fokus på patologisk utvikling av fusjoner. Det ble gjennomført et eksperimentelt forsøk hvor fisk ble eksponert for to ulike temperaturregimer fra befruktning frem til 15g størrelse. Fisk utsatt for høy temperatur viste en langt høyere vekstrate og en betydelig høyere andel av vertebrale fusjoner enn fisk som hadde blitt utsatt for lave temperaturer. Ved å analysere ikke-deformerte virvler fra de to temperaturregimene viste det seg at den økte risikoen for å utvikle fusjoner var knyttet til en nedregulert transkripsjon av gener involvert i produksjon og mineralisering av ekstracellulær matriks (artikkel I). Det ble også funnet at rask vekst forstyrrer produksjon av både ben- og bruskdannelse. Morfologiske analyser av bruskområdene viste at chondrocyttene hadde et forandret modningsmønster og en økt sone av hypertrofe chondrocytter. Dataene som presenteres viser at rask vekst forstyrrer produksjon av både ben- og bruskdannelse. I artikkel II og III ble typiske utviklingstrekk i fusjonsprosessen beskrevet. Et intermediært og et terminalt stadium av fusjonsprosessen ble studert morfologisk ved hjelp av røntgenundersøkelser og histologi og på et molekylært nivå ved hjelp av kvantitativ real-time PCR, in situ hybridisering og immunohistokjemi. I artikkel II var fokuset rettet mot ben- og bruskdannelse i virvlene, mens i artikkel III ble notokorden analysert. Utviklingen av vertebrale fusjoner er en dynamisk prosess, men som foreslått i denne avhandlingen kan prosessen oppsummeres i fire store hovedmomenter. For det første observerte vi uorganiserte og prolifererende celler i vekstsonene på toppen av virvlene. Grensen mellom osteoblast- og chondrocyttområdene ble mindre tydelig ettersom de prolifererende cellene blandet seg og dannet en overgangssone (artikkel II). For det andre viste in situ hybridisering at disse prolifererende cellene uttrykte både chondrogene og osteogene genmarkører, noe som tyder på et metaplastisk skifte i disse cellene (artikkel II). Et tilsvarende skifte oppstod også i notokorden der prolifererende chordoblaster forandret transkripsjonsprofil til en mer osteogen fenotype (artikkel II og III). For det tredje ble notokordskjeden strukket og den elastiske membranen som omgir notokorden ble tynnere og mer fragmentert ettersom patologien utviklet seg (artikkel III). Immunohistokjemi avdekket videre at den strukturelle oppbyggingen av notokordskjeden ble forandret under utviklingen av fusjoner. For det fjerde ble ektopisk bendannelse oppdaget i bruskområder og i intervertebrale områder (artikkel II). Dannelsen av ektopisk ben indikerte at det metaplastiske skiftet i prolifererende celler førte til celler som var i stand til å mineralisere matriks.
Det primære målet i artikkel IV var å utvikle et in vitro system for osteoblaster fra Atlantisk laks slik at man lettere kan studere spesifikke problemer tilknyttet benutvikling. Uspesialiserte primærceller fra laksens hvite anaerobe muskler ble dyrket i osteogent medium til osteoblastlignende celler. I løpet av differensieringsperioden forandret cellene morfologi fra en avlang form til å bli mer firkantet, de uttrykte osteoblast-spesifikke markører og farget for alkalisk fosfatase. Videre ble de differensierte cellene brukt til å studere effekten av to faktorer som påvirker bendannelse hos oppdrettslaks; høy temperatur og sammensetningen av flerumettede fettsyrer. In vitro responsen viste likheter med in vivo funn og støtter opp om at vi har lykkes i å differensiere forløperceller til osteoblastlignende celler.
Gjennom det arbeidet som presenteres i denne avhandlingen har vi fått en bedre kunnskap om den normale og den patologiske utvikling av ryggvirvlene hos Atlantisk laks. De fleste markører for ben- og bruskutvikling har ikke vært beskrevet tidligere i laksefisk. De definerte markørene kan brukes til å undersøke hvordan utviklingen av ryggraden påvirkes av en rekke faktorer og viser potensialet for bruk av gentranskripsjon som en prognostisk tilnærming i akvakultur. Videre har Atlantisk laks vist seg å være sammenlignbar med pattedyrmodeller som brukes til å undersøke den komplekse patologien involvert i utviklingen av ryggmisdannelser.
