| Sidenavigasjon: Hovedside / Institutter / Husdyr- og akvakulturvitenskap |
[Sidekart] [Kontakt] 
|
| Tekststørrelse. |
Harald Takle - abstract fra doktorgradsavhandling
Ane Gro Siri SkjelfjordAbstract fra avhandlingen
Temperature-induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar) embryos - Identification of temperature sensitive developmental stages and organs, and characterization of candidate genes for heat-induced malformations
English language abstract
Deformities are a recurrent problem of all modern aquaculture production and represent both ethical and economical challenges for the industry. A range of intrinsic and extrinsic factors has been found to induce deformities of skeletal structures and soft tissue, including missing septum transversum and anomalies of the swimbladder. In salmon aquaculture, the teratogenic effects of temperature are of special interest, as temperature manipulations are a powerful and commonly used tool to regulate developmental rate of fish embryos, which are particularly vulnerable to thermal stress. The aim of the work described in this thesis was to increase the general understanding of temperature-induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar) embryos by identifying temperature sensitive developmental stages, organs and tissues, and candidate genes possibly involved in development of specific deformities.
In Paper I, the sensitivity towards temperature stress was found to vary during early embryonic development as shown by real-time RT-PCR expression analysis of the heat shock protein gene HSP70 and diagnostic examinations of deformities. Whereas heat shock (1 h at 16ºC) induced HSP70 transcription at the gastrula stage, the ~9th, ~15th, ~20th and ~45th somite stage, no HSP70 up-regulation was found at the ~1st or ~25th somite stage, or at the completion of somitogenesis. Moreover, the fry originating from the latter stages showed the overall lowest incidences of deformities when examined at 20 grams. Altogether, this suggests that salmon embryos are particularly vulnerable to temperature stress at the gastrula stage, during the early somitogenesis and at the ~45th somite stage. In addition, results from Paper I showed cold shock (1 h at 1 ºC) induced up-regulation of HSP70 and incidences of missing septum transversum, indicating that a sudden drop in water temperature may be harmful also in cold-water species.
To identify temperature sensitive organs and tissues, five apoptosis genes encoding executioner caspase-3A, -3B, -6A, -6B and -7 were cloned from Atlantic salmon (Paper II). Whereas a partial caspase-3A cDNA was isolated, the full-length caspase-3B encodes the inactive proenzyme of 279 amino acids (aa) consisting of an N-terminal prodomain and a large and a small subunit similar to the salmon caspase-6A and caspase-6B proenzymes. Unexpectedly, the deduced salmon caspase-7 enzyme is only 245 aa and lacks the prodomain and part of the large subunit analogous to the predicted caspase-7 of Tetraodon. Whole-mount in situ hybridization of the salmon embryo identified caspase-7 mRNA in the lens exclusively, while caspase-3B and caspase-6A/B were expressed in multiple tissues of exposed and control embryos. Intriguingly, caspase-6A/B mRNA was only detected in the heart of heat exposed embryos, suggesting that the heart is a temperature sensitive organ in teleosts (bony fish) as shown in Paper IV. In addition, diagnostic examinations in Paper I and IV identified the swimbladder and septum transversum as a temperature sensitive organ and tissue, respectively. Moreover, temperature stress may induce skeletal deformities and defects in the central nervous system (CNS) of vertebrates.
The purpose of Paper III was to identify hyperthermia sensitive candidate genes involved in development of deformities by RNA arbitrarily primed (RAP)-PCR. Whereas the cysteine and tyrosin-rich 1 (CYYR1) gene was the only down-regulated transcript identified, atrial natriuretic peptide (ANP), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 were found to be up-regulated after long-term heat exposure in salmon embryos. The cardiac hormone ANP was considered to be the most interesting candidate, as ANP has been shown to be involved in negative growth regulation of cardiac muscle cells and because cardiac malformations are recognized as an increasing problem in salmon aquaculture. In Paper IV, RT-PCR results showed heat-induced up-regulation of ANP expression from the ~15th somite stage till completion of somitogenesis. The increased amount of ANP mRNA in hyperthermic salmon hearts was confirmed by in situ hybridization at the ~20th somite stage. In a separate study, salmon embryos incubated at 10 ºC showed increased ANP transcription during the somitogenesis, incidences of missing septum transversum and significantly decreased cardiosomatic index (CSI; (ventricle weight/body weight)* 100) compared with controls incubated at 8 ºC. Taken together, the results indicated that hyperthermia induces both ANP transcription and deviant development of the heart and associated structures. Thus, a possible role of ANP in deviant heart development is suggested.
Pr. desember 2006:
Harald Takle, AKVAFORSK, Postboks 5010, 1432 Ås
Norsk sammendrag
Temperaturinduserte deformiteter hos embryo fra Atlantisk laks (Salmo salar) - Identifisering av temperatursensitive utviklingsstadier og organer, samt karakterisering av kandidatgener for varmeinduserte misdannelser
I moderne fiskeoppdrett er deformiteter et stadig tilbakevendende problem som medfører etiske og økonomiske utfordringer for industrien. En rekke interne og eksterne faktorer kan indusere deformiteter i skjelettstrukturer og bløtvev, inkludert manglende septum transversum og svømmeblæreanomalier. I lakseoppdrettsnæringa er de teratogene effektene av temperatur spesielt interessante. Dette skyldes at temperaturmanipulering er et kraftig og velbrukt verktøy for å fremskynde utviklingen hos fiskeembryo, som er spesielt sårbare overfor temperaturstress. Målet med arbeidet beskrevet i denne avhandlingen var å øke den generelle forståelsen av temperaturinduserte deformiteter hos embryo fra Atlantisk laks (Salmo salar) ved å identifisere temperatursensitive utviklingsstadier, organer og vev, samt kandidatgener muligens involvert i utvikling av spesifikke deformiteter.
I Artikkel I ble det funnet varierende sensitivitet mot temperaturstress under tidlig embryoutvikling ved real-time RT-PCR ekspresjonsanalyser av genet som koder for varmesjokkproteinet HSP70 og diagnostiske undersøkelser av deformiteter. Varmesjokk (1 time ved 16ºC) induserte HSP70-transkripsjon på gastrula-stadiet, det ~9., ~15., ~20., og ~45. somitt-stadiet, mens det ikke ble funnet noen HSP70-oppregulering på det ~1. eller ~25. somitt-stadiet, eller ved avslutningen av somitogenesen. Undersøkelser av 20 grams yngel fra de ulike forsøksgruppene viste at yngelen som stammet fra de sistnevnte stadiene hadde lavest forekomst av deformiteter. Resultatene indikerer at lakseembryo er særlig utsatt for temperaturstress på gastrula-stadiet, den tidlige fasen av somitogenesen og på ~45. somitt-stadiet. Resultater fra Artikkel I viste i tillegg at kuldesjokk (1 time ved 1ºC) induserte oppregulering av HSP70 og tilfeller av manglende septum transversum. Dette indikerer at et plutselig fall i vanntemperaturen kan være skadelig også for kaldtvannsarter.
For å identifisere temperatursensitive organer og vev ble fem apoptose-gener som koder for executioner caspase-3A, -3B, -6A, -6B og –7 klonet hos Atlantisk laks (Artikkel II). Caspase-3A cDNA-sekvensen ble delvis isolert, mens full-lengde-sekvensen av caspase-3B koder for det inaktive proenzymet på 279 amino syrer (as) bestående av et N-terminalt prodomene og en stor og en liten subenhet tilsvarende laksens caspase-6A og caspase-6B proenzymer. Den deduserte laksevarianten av caspase-7 består uventet av bare 245 as og den mangler prodomenet og deler av den store subenheten, analogt den predikerte caspase-7-varianten fra Tetraodon. In situ hybridisering påviste linsespesifikk caspase-7 mRNA ekspresjon, mens caspase-3B og caspase 6A/B var uttrykt i mangfoldige vev hos eksponerte- og kontrollembryo. Caspase-6A/B mRNA ble derimot bare detektert i hjertet på varmeeksponerte embryo. Dette antyder at hjertet er et temperatursensitivt organ hos teleoster (beinfisk), slik som resultatene i Artikkel IV også antyder. Diagnostiske undersøkelser viste i tillegg at svømmeblæra og septum transversum er henholdsvis et temperatursensitivt organ og vev (Artikkel I og IV). Dessuten kan temperaturstress indusere skjelettdeformiteter og feil i sentralnervesystemet (CNS) hos vertebrater.
Formålet med Artikkel III var å identifisere hypertermisensitive kandidatgener involvert i utvikling av deformiteter ved RAN arbitrarily primed (RAP)-PCR. Det eneste nedregulerte genet var cystein og tyrosin-rik1 (CYYR1), mens atrial natriuretisk peptid (ANP), heterogent kjerne ribonucleoprotein (hnRNP) A0, acyl CoA bindende protein (ACBP) og mitrokondrielt (mt)-HSP70 viste en oppregulering etter langvarig varmeeksponering av lakseembryo. Det kardiale hormonet ANP ble antatt å være den mest interessante kandidaten, fordi ANP har vist seg å være involvert i negativ vekstregulering av hjertemuskelceller og fordi hjertemisdannelser er anerkjent som et økende problem i laksenæringa. I Artikkel IV viste RT-PCR resultater at varme induserer oppregulering av ANP-ekspresjonen fra og med det ~15. somitt-stadiet og frem til avslutningen av somitogenesen. Den økte mengden av ANP mRNA i hypertermiske laksehjerter ble bekreftet i embryo fra det ~20. somitt-stadie ved in situ hybridisering. Økt ANP transkripsjon under somitogenesen ble også påvist hos embryo inkubert ved 10ºC i et atskilt ekspresjonsstudie. Disse lakseembryoene viste manglende septum transversum og hadde signifikant lavere kardiosomatisk-indeks (CSI; (ventrikkelvekt/kroppsvekt)*100) sammenliket med kontrollene som var inkubert ved 8ºC. Hypertermi kan derfor indusere både ANP-transkripsjon og avvikende utvikling av hjertet og tilhørende strukturer. Resultatene samlet kan indikere at ANP spiller en rolle i utviklingen av avvikende hjerter.
Til toppen
Publisert: 01.12.08
Oppdatert: 07.01.09
Utskriftsvennlig versjon
Del med en venn:
Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap