Molecular and chemical characterization of the rumen microbiota and quantification of rumen microbial protein synthesis
English language abstract The objectives of the present work were to (1) examine the changes in bacterial ecology in rumen liquid in dairy cows during induced subacute rumen acidosis (SARA) using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE; Paper III), (2) quantify two specific ruminal bacteria involved in lactate metabolism (Megasphaera elsdenii and Streptococcus bovis) in dairy cows suffering from SARA using real-time polymerase chain reaction (PCR; Paper III), (3) examine the postprandial changes in the chemical composition of ruminal microbial fractions isolated from crude rumen content (Paper II), (4) examine the chemical composition of ruminal microbial fractions in relation to diet composition (Paper II), (5) investigate how dairy cows utilize energy and nitrogen (N) from silage prepared from timothy (Phleum pratense) alone or in mixture with different proportions of red clover (Trifolium pratense) in synchronization with a high level of rumen degradable carbohydrates (Paper I), and (6) calculate the relative contribution from feed and different microbial fractions to the total duodenal flow of nutrients (Papers I and II).
Substitution of grass silage (timothy) with silages containing red clover (23 and 46% on DM basis) at equal DM intake had no major effect on the duodenal flow of nitrogenous compounds; however, the total tract digestibility of both CP and aNDF was higher than in the cows fed grass silage (Paper I). The N metabolism in the cows fed the grass/clover silages changed slightly as was shown by a higher concentration of ammonia in the rumen and a higher concentration of urea in blood and milk, ultimately leading to an increased excretion of N in urine. Although the cows fed the grass/clover silages had a slightly lower efficiency in microbial protein (MP) synthesis (22.5 and 23.0 grams of MP/kg truly digested organic matter vs. 26.8 in cows fed the grass silage) and a lower efficiency in converting feed N into milk N (26.1% and 25.4% of ingested N vs. 27.6% for the grass silage), the daily milk production (+3.5 and +4.5 kg of milk per day) and milk N output was higher (+11 and +17 grams of milk N per day).
The chemical composition of liquid-associated protozoa (LAP), liquid-associated bacteria (LAB), solid loosely-attached bacteria (SLB) and solid-adherent bacteria (SAB), isolated from crude rumen contents at different times in relation to feeding, was examined in three in vivo feeding trials (Paper II). The chemical composition of the four microbial fractions was affected by both the diet composition, feeding level and time of isolation in relation to feeding. Thus to obtain a representative microbial reference sample for the calculation of MP synthesis in the rumen and MP flow to the duodenum, more than one time of isolation should be carried out. The average content of nucleic acid base-N (NAB-N) per 100 g N was 10.1, and the SLB fraction contained more NAB-N per 100 g N than the other three microbial fractions, indicating a higher rate of cell proliferation than in the other isolated microbial fractions. By using the profiles of the individual NAB in feed, microbial fractions and duodenal digesta, it was possible to partition the duodenal flow of NAB into dietary or microbial origin time using a least squares optimization procedure: 5.7% originated from exogenous NAB in the feed, 8.2% from LAP, 29.7% from LAB, 25.6% from SLB and 30.8% from SAB (average values from three experiments). The NAB originating from the feed may therefore be neglected when measuring rumen MP synthesis and flow to the duodenum.
After the induction of SARA, all cows reached non-physiological pH values in the rumen (Paper III). However, no accumulation of lactate in the rumen or defaunation was observed. The low concentration of lactate in the rumen may be explained by the fact that the lactate utilizer Megasphaera elsdenii outnumbered the lactate producer Streptococcus bovis as quantified by real-time PCR. This study also demonstrated that there is a considerable variation between individual cows in the capacity to tolerate large amounts of easily degradable starch (from 5.9 to 22.6 kg DM of concentrate was ingested at the time of SARA). Likewise, the V3-DGGE fingerprints also suggested that there is a greater difference in the bacterial ecology in the rumen liquid between animals than between the same types of sample (i.e. start, middle, acidosis or recovery), collected from different animals (i.e. clustering with respect to animal). Members of the Prevotella spp. appeared to be the most dominating group of bacteria in this trial (77% of 140 16S rRNA gene sequences recovered from the DGGE gels). A total of 89% of the 16S rRNA gene sequences belonged to the phylum of Bacteroidetes, whereas the remaining 11% could be confirmed as Firmicutes (5.0%), Proteobacteria (4.6%) and Actinobacteria (1.4%).
Pr. september 2005: Liv Torunn Mydland, APC, c/o UMB, IHA, Postboks 5003, 1432 Ås
Norsk sammendrag
Molekylær og kjemisk karakterisering av vommikrober og kvantifisering av mikrobiell proteinsyntese i vom
Hovedmålsetningene i denne avhandlingen har vært å (1) undersøke endringer i mikrobepopulasjonene i vomvæske fra melkekyr med indusert subakutt vom-acidose (SARA) v.h.a. denaturerende gradient gelelektroforese (DGGE; Artikkel III), (2) kvantifisere to spesifikke vombakterier som er involvert i laktat-omsetningen (Megasphaera elsdenii og Streptococcus bovis) hos melkekyr som lider av SARA v.h.a. real-time polymerase chain reaction (PCR; Artikkel III); (3) undersøke effekten av tid etter fôring på den kjemiske sammensetningen av de fire ulike fraksjonene av vommikrober (Artikkel II), (4) undersøke effekten av ulike fôrrasjoner på den kjemiske sammensetningen av de fire ulike fraksjonene med vommikrober (Artikkel II), (5) undersøke hvordan melkekyr utnytter energi og nitrogen (N) fra surfôr av timotei (Phleum pratense) alene eller i blanding med forskjellige andeler av rødkløver (Trifolium pratense), gitt i synkroni med et høyt nivå av vomfordøyelige karbohydrater (Artikkel I), og (6) beregne det relative bidraget fra fôret og de ulike mikrobefraksjonene til den totale passasjen av næringsstoffer ved duodenum (Artiklene I og II).
Å erstatte gras-surfôr (timotei) med surfôr som inneholdt rødkløver (23 og 46% på TS basis), ved samme TS inntak, hadde liten effekt på passasje av nitrogenholdige forbindelser til duodenum, men totalfordøyeligheten av både råprotein og aNDF var høyere (Artikkel I). N-omsetningen i kuene som fikk surfôr med timotei/kløver, ble imidlertid noe endret da disse kuene viste høyere ammoniakk-konsentrasjoner i vomma og høyere urea-konsentrasjoner i blod og melk, noe som igjen førte til økt utskillelse av N i urin. Selv om kuene som hadde fått gras/kløver surfôr viste en noe lavere effektivitet i den mikrobielle protein (MP) syntesen (22,5 og 23,0 gram MP/kg sann fordøyd organisk stoff mot 26,8 i kuene som fikk gras-surfôr) og en lavere konverteringsfaktor for fôr-N til melk-N (26,1% og 25,4% av inntatt N mot 27,6% for kuene som fikk gras-surfôr), ble både den daglige melkeproduksjonen (+3,5 og 4,5 kg melk per dag) og N-utskillelsen i melk høyere (+11 og 17 gram N i melk per dag).
Den kjemiske sammensetningen av væskefase protozoer (LAP), væskefase bakterier (LAB), løst partikkelbundne bakterier (SLB) og partikkelbundne bakterier (SAB) isolert fra innholdet i vomma ved ulike tider i forhold til fôring, ble undersøkt i tre ulike in vivo fôringsforsøk (Artikkel II). Den kjemiske komposisjonen av de fire ulike mikrobepopulasjonene var påvirket av både sammensetningen av fôret, fôrnivået og tidspunktet for isolering i forhold til fôring, så for å få en representativ referanseprøve for å kalkulere den mikrobielle proteinsyntesen i vom og passasjen av N til duodenum, bør mer enn et tidspunkt for isolering utføres. Det gjennomsnittlige innholdet av nukleinsyre-N (NAB-N) per 100 g N var 10,1, og SLB fraksjonen inneholdt mer NAB-N per 100 g N enn de andre tre mikrobefraksjonene. Dette indikerer at SLB har en høyere hastighet på celledelingen enn de andre mikrobefraksjonene. Ved å bruke profilen til de ulike NAB i fôret, mikrobefraksjonene, og duodenalchymet, var det mulig å spore opprinnelsen til passasjen av NAB ved duodenum tilbake til fôret og mikrobene v.h.a. en minste kvadrats optimaliseringsprosedyre: 5,7% kom fra de eksogene NAB i fôret, 8,2% kom fra LAP, 29,7% kom fra LAB, 25,6% kom fra SLB og 30,8% kom fra SAB (gjennomsnittlige verdier fra tre forsøk). NAB som stammer fra fôret kan derfor bli neglisjert når man skal kalkulere den mikrobielle proteinsyntesen i vom.
Etter indusering av SARA fikk alle kuene ikke-fysiologiske pH-verdier i vomma, men det oppstod ingen akkumulering av laktat i vomma og defaunering ble ikke observert (Artikkel III). Den lave konsentrasjonen av laktat i vomma kan forklares ut i fra at laktatforbrukeren Megasphaera elsdenii var overlegen i antall i forhold til laktatprodusenten Streptococcus bovis (kvanitfisert v.h.a. real-time PCR). En betydelig variasjon ble observert mellom dyr når det gjaldt kapasiteten for å tolerere store mengder med inntatt stivelse (fra 5,9 til 22,6 kg TS med kraftfôr ble inntatt per dag når SARA ble diagnostisert). Likeledes viste V3-DGGE profilene også at det var større forskjell i den bakterielle økologien i vomvæska mellom dyr enn i samme type prøve (starten, midten, acidose eller restitusjon), tatt fra ulike dyr (d.v.s. en gruppering m.h.p. dyr). Den mest dominerende gruppen av bakterier i dette forsøket var Prevotella spp. (77% av de 140 16S rRNA gen fragmentene som ble sekvensiert fra DGGE gelene). Totalt sett ble 89% av 16S rRNA gen sekvensene identifisert til å tilhøre fylumet Bacteroidetes, mens de resterende 11% ble bestemt til å tilhøre Firmicutes (5.0%), Proteobacteria (4.6%) og Actinobacteria (1.4%).
